<ruby id="zbzzx"><b id="zbzzx"></b></ruby>
<pre id="zbzzx"><ruby id="zbzzx"><mark id="zbzzx"></mark></ruby></pre>
    首頁/ 產品速遞 / 新聞詳情

    常見非編碼RNA如何進行反轉錄?

    核糖核酸(RNA)存在于生物細胞、部分病毒以及類病毒中,種類繁多,功能復雜,一般按照是否編碼蛋白質將其分為編碼RNA和非編碼RNA兩大類。編碼RNA通常指mRNA,非編碼RNA則包括很多種類,可以分為長度大于200nt的非編碼大RNA、長度小于200nt的非編碼小RNA以及特殊的非編碼circRNA。非編碼大RNA包括rRNA,LncRNA。非編碼小RNA包括miRNA、siRNA、piRNA、scRNA等。

     

    此外,非編碼RNA也可以按照表達和功能特性分為細胞生存所必需的管家非編碼RNA和時空特異性表達的調節非編碼RNA。

     

     

     


    在近些年國自然中標項目中,以非編碼RNA為研究主線的主要是miRNA、circRNA、LncRNA和CeRNA,其中CeRNA并不是一種新的RNA分子,只是一種新發現的基因表達調節機制。相較于常見的mRNA反轉錄不同,上述RNA進行反轉錄時有著各自的特點與要求。

     

     

     

    miRNA反轉錄

     

    成熟的miRNA的長度只有20nt左右,通常正向引物就會覆蓋其全長甚至會有多余部分,反向引物就無處安置了。目前市面上解決方案就是在反轉錄時設法增加反轉錄產物長度。常見的方法有加尾法和莖環法。

     

    加尾法利用PolyA 聚合酶為成熟的miRNA加上Poly(A)尾,以帶有通用序列的Oligo-dT作為反轉錄引物,合成加長的miRNA對應cDNA第一鏈。莖環法以折疊為莖環結構的通用序列作為引物合成加長的miRNA對應cDNA第一鏈,后續擴增過程中,莖環結構在適宜的溫度下會被打開,和相關擴增引物結合。
     


    圖. 加尾法合成cDNA


    圖.莖環法合成cDNA
     

     

     

    circRNA反轉錄

     

     

    circRNA是通過特殊選擇性剪切產生的封閉環狀結構非編碼RNA。不受RNA外切酶的影響,比線性RNA更穩定。由于circRNA沒有3‘ poly(A)尾,一般不使用oligo dT作為反轉引物,可選用隨機引物(random primers N6或N9均可)進行反轉錄。

     

    但需要注意的是,通常提取的RNA中含有大量線性RNA,傳統的逆轉錄酶難以區分環狀和線性RNA,建議在進行circRNA反轉錄時,事先用RNA酶R處理線性RNA以使circRNA得到富集,從而減少錯誤或偏倚發生。

    圖.circRNA反轉錄合成cDNA
     

     

     

    LncRNA反轉錄

     

    LncRNA是長度大于 200 個核苷酸的非編碼 RNA,具有mRNA樣結構,經過剪接,有些具有poly(A)尾巴,有些則沒有poly(A)尾巴,表達量相對較低。研究表明,LncRNA在劑量補償效應、表觀遺傳調控、細胞周期調控和細胞分化調控等眾多生命活動中發揮著重要的作用。在進行反轉錄時,建議選用隨機引物(random primers N6或N9均可)或基因特異性引物進行反轉錄。
     

    圖.LncRNA反轉錄合成cDNA
     

     

     

    產品推薦

     

     

    翌圣miRNA加尾法反轉定量組合(11148ES&11171ES)

     

    1663815729306046.png

    11148ES-Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit

     

    試劑盒采用加尾法來進行miRNA第一鏈cDNA的反轉錄,產品中的2×Hifair® miRNA RT buffer包含了miRNA加尾反應和反轉錄反應的所有原料和引物,并經過精心優化,可保證miRNA 3‘末端的Poly(A)修飾過程和反轉錄過程同時高效進行。

    1663815756143743.png

    11171ES -Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

     

    專門為miRNA定量檢測而研發的新一代預混形式的熒光定量PCR檢測試劑,含有特殊的ROX Passive Reference Dye,適用于所有qPCR儀器,無需在不同的儀器上調整ROX的濃度,只需在配制反應體系時加入引物和模板即可進行擴增。DNA 聚合酶采用化學修飾的熱啟動聚合酶,配合特殊的Buffer體系,使反應特異性更好,靈敏度更高,并能在更廣的范圍內進行準確定量。

     

     

    產品性能

    可兼容全平臺qPCR儀器

    圖. 以293T細胞的Total RNA為模板,用Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)進行反轉錄,獲得的cDNA稀釋10倍后,用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分別檢測hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、U6內參基因。

     

    檢出率高,最高可達10 pg

     

    圖. 以人工合成hsa-miR-let-7e-5p(a)和293T細胞Total RNA(b)為模板,分別稀釋成以下梯度:60拷貝到606拷貝(6個梯度)和10 pg-100 ng(5個梯度),用Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)進行反轉錄,獲得的cDNA用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)檢測hsa-miR-let-7e-5p基因表達情況。

     

    高特異性,能區分同家族miRNA間單堿基差異

    圖. 人類hsa-let-7家族擁有多條miRNA,彼此間相差的堿基很少,甚至只有單堿基的差異。每個Let-7亞型(hsa-miR-let-7a~Let-7i,has-miR-98)的人工合成miRNA使用 Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)進行反轉錄合成cDNA,以不用的引物,用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分別擴增這些miRNA,利用公式2-ΔCTx 100%計算匹配率。結果顯示,可有效區分密切相關的亞型家族成員。

     

     

    擴增效率出色

     

     

    圖. 以人293T細胞和鼠源肝臟Total RNA為模板,擴增miR-let-7b-5p、miR-let-7c-5p、miR-let-7e-5p、miR-let-7f-5p基因。結果顯示,與同類產品相比,Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)配套 Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)的反應體系,具有優異的表現。

     

     

    穩定性優秀,在 37℃穩定7天或凍融50次或配置體系在25℃保留48 h,效果依舊穩定

     

    圖. 以293T細胞Total RNA為模板用Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES) 進行反轉錄,獲得的cDNA稀釋10倍,用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) 檢測hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、hsa-miR-let-7e-5p的表達情況?!鰿t<0.5。 

     

    翌圣高效靈活反轉錄試劑盒(11139ES)


    11139ES-Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

     

    該試劑盒基于Hifair® III Reverse Transcriptase而開發。該酶cDNA合成速度快,且熱穩定性大幅度提高,可耐受高達60℃的反應溫度,適合具有復雜二級結構的RNA模板的反轉錄??筛鶕芯康腞NA類型,靈活選擇所需引物進行反轉錄。同時,該酶增強了與模板的親和力,適合少量模板以及低拷貝基因的反轉錄。Hifair® III Reverse Transcriptase合成全長cDNA的能力也有了提升,可合成長達19.8 kb的cDNA。
     

     

    優越的延伸性能,可合成19.8kb的cDNA

    圖. 以500ng 293T細胞的總RNA為模板,oligodT為引物,使用11139ES合cDNA。取1μL cDNA為模板,使用Hieff® Canace Gold 高保真酶(Cat NO.10148ES)擴增DY1C1N1基因(19.8kb)的5’的500bp。M: 1kb DNA ladder.

     

     

    線性檢測范圍廣,Total RNA 10pg-5μg

    圖.以10pg-5μg的293T細胞的總RNA為模板,使用11139ES合成cDNA。取1μL cDNA為模板,使用Hieff UNICON® Power qPCR 預混液 (Cat NO.11195ES)擴增基因。 

     

     

    相關產品推薦

     

     

    400-6111-883

    亚洲国产欧美日本精品,网站免费观看国产精品,国产午夜精品久久精品电影_观看