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    細胞轉染實驗操作注意事項(上)

    細胞轉染從開始設計到最終的檢測,大致可以由6個步驟組成:核酸準備、試劑選擇、細胞鋪板、轉染操作、細胞培養、效果檢測。每一步都會影響最終的結果,均存在不同的注意事項。


    1663912441135124.png

     

     

     

    一、核酸準備
     
     

    A

     質粒的構建

     

     

    1)強度合適的啟動子:在構建表達質粒的時候,有一些基因編碼出來的蛋白是對細胞有毒性的蛋白,表達會導致細胞死亡。面對這種情況需選擇較弱的啟動子或者可以誘導的啟動子限制毒性基因產物表達對細胞造成的損害。啟動子的選擇對于轉染基因的有效表達是非常重要的,對于轉染過程本身雖然無甚影響,但是對轉染結果卻有著微妙的影響。如果基因產物對細胞有毒性作用,轉染也很難進行。
    2)siRNA表達載體的使用:這種方法總體的優點在于不需要直接操作RNA,能達到較長時間的基因沉默效果。大大提高siRNA表達載體對宿主細胞的侵染性,徹底克服某些細胞轉染效率低的障礙,是實現哺乳動物細胞siRNAs瞬時表達與穩定表達的理想工具。

     

    B

     質粒的大小和質量

     

    1)質粒的形態與大小:線性化還是超螺旋會影響轉染結果,超螺旋質粒的轉染效率比線性DNA高得多,特別是瞬時轉染。質粒太大了轉染會困難一些。
    2)核酸質量對轉染效率影響非常大:一般的轉染技術基于電荷吸引原理,如果不純,如帶少量的鹽離子,蛋白,代謝物污染都會顯著影響轉染復合物的有效形成及轉染的進行。
    用于轉染的質粒DNA必須無蛋白質,無RNA和其他化學物質的污染,應確保質粒OD值A260/A280 在1.8~2.0之間。如果DNA不純,如帶少量的鹽離子,蛋白、代謝物污染都會顯著影響轉染復合物的有效形成及轉染的進行。
    3)內毒素:內毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的一種成分,目前用的質粒大部分是從大腸桿菌中提取出來的。內毒素通常在質粒制備的裂解中釋放出來并與質粒DNA共存,內毒素會導致轉染效率顯著下降,特別是對內毒素敏感細胞比如原代細胞、懸浮細胞和造血細胞或者想要獲得最高的轉染效率和最低的細胞毒性。

     

    C

     質粒共轉染

     

    合適的比例搭配:對于多個質粒的共轉染,每孔DNA的總量不應超過說明書中標明的DNA量。每個質粒的比例根據質粒的大小、結構與預期的各質粒的表達水平而定。在每孔中,每個質粒至少應占總DNA量的10%以上。

     

     

     

    二、試劑選擇
     
     

    現在市面上轉染試劑種類繁多,質量良莠不齊,如何選擇一款合適的轉染試劑會顯得比較棘手。在考慮合適的轉染試劑時,要考慮轉染的物質(DNA、RNA、蛋白)以及要轉染的細胞特性。
    一款好的轉染試劑,要具有較高的轉染效率,較低的細胞毒性和較合適的價格。
    不同細胞系轉染效率通常不同,但細胞系的選擇通常是根據實驗的需要,因此在轉染實驗前應根據實驗要求和細胞特性選擇適合的轉染試劑。罕見的細胞培養,如神經元和原代細胞等通常難以轉染,在轉染試劑選擇時候更需要慎重與預期的降低。

     

    三、細胞鋪板
     
     

    1)細胞狀態:健康的細胞培養物是成功轉染的基礎。最適合轉染的細胞是經過幾次傳代后達到指數生長期的細胞,細胞生長旺盛,最容易轉染。高的轉染效率需要一定的細胞密度,一般的轉染試劑都會有專門的說明。如為貼壁生長細胞,一般要求在轉染前一日,必須應用胰酶處理成單細胞懸液,重新接種于培養皿或,一般轉染時貼壁細胞密度為50%-90%,但這個需要參考所選轉染試劑的說明書,盡量在細胞最合適的生理狀態下轉染,以求最佳的轉染效果。
    2)實驗目的:不同的實驗目的也會影響轉染時的鋪板密度,比如研究細胞周期相關基因等表達周期長的基因,就需要較低的鋪板密度。

    限于篇幅,本次就分享到這里,下半部分將會在后續分享。
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    翌圣明星CP--轉染試劑與PCR產品又登《Cell》期刊
    以下僅展示部分論文: 

     

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    [1] Liu R, Yang J, et al. Optogenetic control of RNA function and metabolism using engineered light-switchable RNA-binding proteins. Nat Biotechnol. 2022 Jan 3. (IF:55)華東理工大學生物工程學院楊弋團隊

    [2] Zhou J, Chen P, et al. Cas12a variants designed for lower genome-wide off-target effect through stringent PAM recognition. Mol Ther. 2022 Jan 5.(IF:11.454)武漢大學生命科學學院殷雷團隊

    [3] Chen S, Cao X, et al. circVAMP3 Drives CAPRIN1 Phase Separation and Inhibits Hepatocellular Carcinoma by Suppressing c-Myc Translation. Adv Sci (Weinh). 2022 Jan 24.(IF:16.808)中國科學院北京生命科學研究院趙方慶團隊

    [4] Gu C, Wang Y, et al. AHSA1 is a promising therapeutic target for cellular proliferation and proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma. J Exp Clin Cancer Res. 2022 Jan 6.(11.161)南京中醫藥大學楊燁顧春艷團隊

    [5] Zhang Y, Yu X, et al. Splicing factor arginine/serine-rich 8 promotes multiple myeloma malignancy and bone lesion through alternative splicing of CACYBP and exosome-based cellular communication. Clin Transl Med. 2022 Feb.(11.492)南京中醫藥大學楊燁顧春艷團隊

    [6] Qin J, Cai Y, et al. Molecular mechanism of agonism and inverse agonism in ghrelin receptor. Nat Commun. 2022 Jan 13.(14.9)四川大學生物治療國家重點實驗室邵振華團隊

    [7] Tang X, Deng Z, et al. A novel protein encoded by circHNRNPU promotes multiple myeloma progression by regulating the bone marrow microenvironment and alternative splicing. J Exp Clin Cancer Res. 2022 Mar 8.(11.161)南京中醫藥大學楊燁顧春艷團隊

    [8] Xie F, Su P, et al. Engineering Extracellular Vesicles Enriched with Palmitoylated ACE2 as COVID-19 Therapy. Adv Mater. 2021 Oct 19. (IF:30.849)蘇州大學生物醫學研究院周芳芳團隊和浙江大學生命科學研究院張龍團隊

    [9] Liang Y, Lu Q, et al. Reactivation of tumour suppressor in breast cancer by enhancer switching through NamiRNA network. Nucleic Acids Res. 2021 Sep 7.(IF:16.9)復旦大學生物醫學研究院于文強團隊

    [10] Fan Y, Wang J, et al. CircNR3C2 promotes HRD1-mediated tumor-suppressive effect via sponging miR-513a-3p in triple-negative breast cancer. Mol Cancer. 2021 Feb 2.(IF:27.403)南京醫科大學附屬逸夫醫院蘇東明團隊

    [11] Dai L, Dai Y, et al. Structural insight into BRCA1-BARD1 complex recruitment to damaged chromatin. Mol Cell. 2021 Jul 1.(IF:17.97)浙江大學生命科學研究院黃俊團隊和中科院生物物理所周政團隊

    [12] Zhang K, Wang A, et al. UBQLN2-HSP70 axis reduces poly-Gly-Ala aggregates and alleviates behavioral defects in the C9ORF72 animal model. Neuron. 2021 Jun 16.(IF:17.17)中國科學院生物與化學交叉研究中心王文元團隊

    [13] Li T, Chen X, et al. A synthetic BRET-based optogenetic device for pulsatile transgene expression enabling glucose homeostasis in mice. Nat Commun. 2021 Jan 27.(IF:14.92)華東理工大學生物工程學院楊弋團隊

    [14] Pan Y, He X, et al. Neuronal activity recruits the CRTC1/CREB axis to drive transcription-dependent autophagy for maintaining late-phase LTD. Cell Rep. 2021 Jul 20.(IF:9.420)浙江大學腦科學與腦醫學學院馬歡團隊

    [15] Liu H, Xing R, et al. G-protein-coupled receptor GPR17 inhibits glioma development by increasing polycomb repressive complex 1-mediated ROS production. Cell Death Dis. 2021 Jun 12.(IF:8.463)廈門大學生命科學學院陳穎團隊

    [16] Yan F, Huang C, et al. Threonine ADP-Ribosylation of Ubiquitin by a Bacterial Effector Family Blocks Host Ubiquitination. Mol Cell. 2020 May 21.(IF:17.97)浙江大學生命科學研究院朱永群團隊

    [17] Luo Q, Wu X, et al. TRIM32/USP11 Balances ARID1A Stability and the Oncogenic/Tumor-Suppressive Status of Squamous Cell Carcinoma. Cell Rep. 2020 Jan 7.(IF:9.42)中國醫學科學院分子腫瘤學國家重點實驗室劉芝華團隊

    [18] Sun X, Peng X, et al. ADNP promotes neural differentiation by modulating Wnt/β-catenin signaling. Nat Commun. 2020 Jun 12.(IF:14.911)中國科學院水生生物研究所孫玉華團隊

    [19] Yang X, Wang H, et al. Rewiring ERBB3 and ERK signaling confers resistance to FGFR1 inhibition in gastrointestinal cancer harbored an ERBB3-E928G mutation. Protein Cell. 2020 Dec.(IF:14.872)浙江大學醫學院/轉化醫學研究院閔軍霞團隊

    [20] Zou Y, Wang A, et al. Analysis of redox landscapes and dynamics in living cells and in vivo using genetically encoded fluorescent sensors. Nat Protoc. 2018 Oct.(IF:13.490)華東理工大學生物工程學院楊弋、趙玉政團隊

    [21] Zhang K, Zhao X, et al. Enhanced Therapeutic Effects of Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes with an Injectable Hydrogel for Hindlimb Ischemia Treatment. ACS Appl Mater Interfaces. 2018 Sep 12.(IF:8.09)南開大學醫學院李宗金團隊

    [22] Hao H, Hu S, et al. Loss of Endothelial CXCR7 Impairs Vascular Homeostasis and Cardiac Remodeling After Myocardial Infarction: Implications for Cardiovascular Drug Discovery. Circulation. 2017 Mar 28.(IF:29.69)中國醫學科學院/北京協和醫學院阜外醫院王淼團隊

     

     

     

     

     

     

     

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    翌圣生物轉染試劑產品目錄

     

    應用場景

    名稱

    貨號

    規格

    細胞類型:貼壁/懸浮核酸類型:DNA、siRNA

    Hieff TransTM Liposomal Transfection Reagent 脂質體核酸轉染試劑

    40802ES01

    100 μL

    40802ES02

    0.5 mL

    40802ES03

    1.0 mL

    40802ES08

    5×1mL

    細胞類型:貼壁/懸浮核酸類型:DNA

    Calcium Phosphate Cell Transfection Kit 磷酸鈣法細胞轉染試劑

    40803ES70

    200 T

    用途:病毒感染+DNA轉染

    Polybrene (hexadimethrine bromide) 聚凝胺(10 mg/ml

    40804ES76

    500 μL

    40804ES86

    5×500 μL

    細胞類型:懸浮核酸類型:DNA、siRNA

    Hieff TransTM Suspension Cell-Free Liposomal Transfection Reagent 懸浮細胞專用脂質體核酸轉染試劑

    40805ES01

    100 μL

    40805ES02

    0.5 mL

    40805ES03

    1.0 mL

    40805ES08

    5×1 mL

    細胞類型:貼壁/懸浮核酸類型:siRNA、miRNA

    Hieff TransTM in vitro siRNA/miRNA Transfection Reagent siRNA/miRNA體外轉染試劑

    40806ES01

    0.1 mL

    40806ES02

    0.5 mL

    40806ES03

    1.0 mL

    細胞類型:貼壁/懸浮核酸類型:DNA、siRNA、miRNA

    Hieff TransTM Universal Transfection Reagent Hieff TransTM通用型轉染試劑

    40808ES02

    0.5 mL

    40808ES03

    1 mL

    40808ES08

    5×1 mL

    細胞類型:貼壁/懸浮核酸類型:DNA

    Polyethylenimine Linear(PEI) MW25000 線性PEI轉染試劑MW25000

    40815ES03

    1 g

    40815ES08

    5×1 g

    細胞類型:貼壁/懸浮核酸類型:DNA

    Polyethylenimine Linear(PEI) MW40000rapid lysis)線性PEI轉染試劑(速溶型)MW40000

    40816ES02

    100 mg

    40816ES03

    1 g

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    400-6111-883

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