產品信息
 

產品名稱	產品編號	規格	價格（元）
Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit	11355ES25	25 T	3465
	11355ES50	50 T	6455
	11355ES60	100 T	9945

產品描述
 

CRISPR/Cas9是一種由RNA指導Cas核酸酶對靶向基因進行特定DNA修飾的技術，源于細菌和古細菌為應對噬菌體和外源質粒的攻擊而演化來的一種獲得性免疫防御機制。在現代生物技術研究中，此系統是通過人工優化的具有引導作用的sgRNA(Single Guide RNA)引導核酸酶Cas9蛋白在與sgRNA配對的靶位點處剪切雙鏈DNA，從而引起DNA斷裂。由于生物體內非同源末端修復機制或同源重組機制修復DNA，導致基因移碼突變、替換或刪除，致使基因功能喪失。

Hifair^® Precision sgRNA Synthesis Kit采用T7 RNA聚合酶混合物高效轉錄spCas9 sgRNA。本試劑盒含有能被Cas9蛋白識別并起支架作用的特異性序列，該序列的一部分能與使用者設計的目標特異序列部分重疊。退火形成互補鏈后由DNA聚合酶進行填充。最終生成用于轉錄的dsDNA模板。本試劑盒利用其提供的試劑和使用者自己設計的特異性DNA序列，單管反應可在4小時內獲得20-100μg具有功能的sgRNA。

產品組分
 

編號	組分	產品編號/規格
		11355ES25 (25 T)	11355ES50 (50 T)	11355ES60 (100 T)
11355-A	10×sgRNA Enzyme Mix	50 μL	100 μL	200 μL
11355-B	10×sgRNA Reaction Buffer	50 μL	100 μL	200 μL
11355-C	2×Canace Enzyme Mix	312.5 μL	625 μL	1.25 mL
11355-D	Scaffold Template	31.25 μL	62.5 μL	125 μL
11355-E	NTPs（25mM each）	200 μL	400 μL	800 μL
11355-F	Control sgRNA Oligo（10μM）	10 μL	20 μL	40 μL

運輸儲存方法
 

干冰運輸。-20℃保存，有效期兩年。

注意事項
 

1. 反應體系中須嚴格注意不要混入RNase。

2. 實驗器材（如：槍頭、產品管等）注意嚴格使用 RNase Free用品。

3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

4. 本產品僅作科研用途！

 

合成原理

 

 

操作流程
 

1. 上游引物（Target-specific sgRNA oligo）設計

A. 引物的5’端：T7啟動子序列加保護堿基（20nt：TTCTAATACGACTCACTATA）

B. 轉錄起始位點：添加0~2個G，添加G的個數由靶序列的5’端決定，T7啟動子至少需要2個G才能有效轉錄。

（注：若特異靶序列已經存在2個G，則不需要額外添加，額外的G會降低剪切效率。）

C. 特異的sgRNA靶序列（20nt）：靶DNA序列PAM（NGG）的5’端20nt堿基序列。

D. 引物的3’端：Scaffold Template退火序列（14nt：GTTTTAGAGCTAGA）。

示例： 

DNA模板：

 

上游引物（Target-specific sgRNA oligo）：

 

 

2. sgRNA合成

A.sgRNA模板擴增

①按下列體系配制反應體系：

組分	體積（μL）	終濃度
RNase free H2O	Up to 25	-
Scaffold Template	1.25	-
sgRNA Oligo（10μM）	1.25	0.5μM
2×Canace Enzyme Mix	12.5	1×

注： 1. Scaffold Template已預先與下游引物混合。

2. 使用試劑、容器等無RNase污染。

②PCR反應程序：

循環步驟	溫度	時間	循環數
變性	98℃	10s	30
延伸	68℃	10s
保持	4℃	∞

③電泳檢測：

使用2%瓊脂糖膠，取5μL PCR反應液電泳檢測條帶大小及亮度，用100bp DNA Ladder（貨號：10507）標定，其大小為120bp左右單一條帶。

B.體外轉錄sgRNA

①按下列體系室溫配制反應體系：

組分	體積（μL）	終濃度
RNase free H2O	Up to 20	-
10×sgRNA Reaction Buffer	2	1×
NTPs (25 mM each)	8	10 mM each
sgRNA模板（上述A獲得）	5	-
10×sgRNA Enzyme Mix	2	1×

注： 1. 低溫配置可能引起DNA模板沉淀。

2. 使用試劑、容器等無RNase污染。

②反應程序：

溫度	時間
37℃	4h
4℃	∞

注：反應于PCR儀中進行，熱蓋打開，防止長時間導致反應液蒸發。

③DNA模板消化：

反應完成后，每管加入2μL DNaseⅠ（RNase free），37℃孵育15min以去除模板DNA。

④轉錄產物純化：

體外轉錄產物可選用 RNA Cleaner 磁珠進行純化（貨號：12602），也可以采用酚/氯仿純化法（具體操作步驟可聯系Yeasen索?。?，以去除蛋白、游離的核苷酸等。

HB200916