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    CHO Host Cell DNA Residue Detection Kit CHO宿主細胞殘留DNA檢測試劑盒

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    產品說明書

    FAQ

    COA

    已發表文獻

    產品信息

     

    產品名稱

    產品編號

    規格

    價格(元)

    CHO Host Cell DNA Residue Detection Kit

    CHO宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒

    41301ES50

    41301ES60

    50T

    100T

    8,895.00

    16,425.00

     

    產品描述

     

    CHO宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒是用于定量分析檢測各種生物制品的中間品、半成品和成品中的CHO殘留DNA含量的試劑盒。

    本試劑盒采用探針法熒光定量PCR原理,專一快速的檢測CHO細胞的殘留DNA,其最低檢測限可以達到fg水平。試劑盒本公司的磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。

     

    產品組分

     

    類別

    組分編號

    組分名稱

    產品編號/規格

    41301ES50(50T)

    41301ES60(100T)

    Part I

    41301-A

    CHO qPCR mix

    1 mL

    2 mL

    41301-B

    DNA Dilution Buffer

    2×2 mL

    4×2 mL

    Part Ⅱ

    41301-C

    CHO DNA Control(30 ng/μL)

    25 μL

    50 μL

    【注】:本試劑盒不含ROX 參比染料,若您目前使用的Real Time PCR擴增儀需要添加ROX參比染料,推薦您購買本公司的50× ROX Reference Dye(Cat#10200ES)。

     

    運輸和保存方法

     

    1. Part I 組分干冰運輸,-20℃保存,有效期2年。

    2. Part II 組分干冰運輸,-80℃保存,有效期2年。

    3. 收到貨后,請檢查Part I 和Part II共2個組分是否齊全,并立即放入對應的保存溫度中儲存。

     

    注意事項

     

    1. 使用本試劑前請仔細閱讀本說明書,實驗應規范操作,包括樣本處理、反應體系的配制及加樣。

    2. 加樣和配液步驟盡量都在冰上操作。

    3. 每個組分在使用前都應充分震蕩混勻,低速離心。

    4. 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。  

    5. 本產品僅作科研用途。

     

    適用機型

     

    包含但不限于以下儀器:

    Bio-Rad:CFX96 Optic Module;

    Thermo Scientific:ABI 7500;ABI Quant Studio 5;ABI Step OnePlus.

     

     

    使用方法

     

    一、CHO DNA定量參考品的稀釋和標準曲線的制備

    用試劑盒中提供的DNA稀釋液將DNA定量參考品進行梯度稀釋,稀釋濃度依次為300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL、3 fg/μL。

    具體操作如下:

    1. 將試劑盒中的DNA 定量參考品和DNA稀釋液置于冰上融化,待完全融化后,輕微振蕩混勻,低速離心10 sec。

    2. 取7支潔凈的1.5 mL離心管,分別標記為 3 ng/μL,①,②,③,④,⑤,⑥。

    3. 在標記為3 ng/μL的1.5mL離心管中加90 μL DNA 稀釋液和10 μL DNA 定量參考品30 ng/μL),即稀釋為3 ng/μL,振蕩混勻后短時間快速離心10 sec,該濃度可分裝置于-80℃短期保存(不超過3個月),使用時避免反復凍融。

    4. 在 ①,②,③,④,⑤,⑥ 管中先分別加入90 μL DNA稀釋液,再進行梯度稀釋,稀釋方法如下:

    稀釋管

    稀釋比例

    終濃度

    10 μL 3 ng/μL+90 μL DNA 稀釋液

    300 pg/μL

    10 μL +90 μL DNA 稀釋液

    30 pg/μL

    10 μL +90 μL DNA 稀釋液

    3 pg/μL

    10 μL +90 μL DNA 稀釋液

    300 fg/μL

    10 μL +90 μL DNA 稀釋液

    30 fg/μL

    10 μL +90 μL DNA 稀釋液

    3 fg/μL

    【注】:

    1. 每個濃度做3個復孔,該試劑可測試3 fg/μL-300 pg/μL線性范圍。需要,可適當擴大縮小線性范圍。

    2. 為減少反復凍融次數和避免污染,建議初次使用時將DNA定量參考品分裝儲存于-80℃。

    3. 已融化未使用的 DNA 稀釋液可保存于2-8 ℃ 7天,長時間不用,請放置于-20℃。

    4. 為確保模板完全混勻,每個梯度稀釋時需輕微震蕩混勻約1 min。

    二、樣本加標回收質控QC的制備

    根據需要設QC中的CHO DNA標準品濃度(以制備加3 pg/μL DNA量的樣本加標回收為例),具體操作如下:

    1. 100 μL待測樣本加入1.5 mL的離心管中,再加入10μL 溶液,混勻,標記為加標回收QC。

    2. 加標回收QC和同批待測樣本一起進行樣本前處理,制備加標回收QC純化液。

    三、標準品回收質控QC的制備(可選)

    根據需要設QC中的CHO DNA標準品濃度(以制備加3 pg/μL DNA量的標準品回收為例),具體操作如下:

    1. 100 μL 溶液加入1.5 mL的離心管中,標記為標準品回收QC。

    2. 標準品回收QC和同批待測樣本一起進行樣本前處理,制備標準品回收QC純化液。

    四、陰性質控NCS的制備

    根據實驗設置陰性質控,具體操作如下:

    1. 100 μL樣本基質溶液(或DNA 稀釋液)加入1.5 mL的離心管中,標記為陰性質控NCS。

    2. 陰性質控NCS和同批待測樣本一起進行樣本前處理,制備成陰性質控NCS純化液。

    、無模板對照NTC的制備

    根據實驗設置無模板對照NTC,具體操作如下:

    1. 無模板對照NTC無需進行樣本前處理,qPCR法檢測殘留DNA含量階段開始配置即可。

    2. 每管或孔中的NTC樣本為20 μL CHO qPCR Mix + 20 μL DNA Dilution Buffer,建議配置3個重復孔的量。

     

     

    、反應體系

    組分

    體積(μL)

    CHO qPCR Mix

    20

    DNA template

    20

    總體積

    40

    【注】:

    1. 根據反應孔數計算本次所需的qPCR Mix總量:qPCR Mix =(反應孔數+2)×20 μL(含有2孔的損失量)。通常,每個樣本做3個重復孔。

    2. 加樣完成密封好管子后,請先低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底,再震蕩混勻5 sec以上,完全混勻反應液,再低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底,如有氣泡,需將氣泡排盡。

    下圖為參考板位:

    image.png 

    該示例是對CHO殘留DNA qPCR法檢測操作的展示,檢測樣本包括:1個無模板對照NTC、6個濃度梯度的DNA標準曲線、3個樣本加標回收QC、3個待測樣本、3個標準品回收QC(可選)、3個陰性質控NCS1個即可)。建議每個樣本3個重復孔。

    、擴增程序參數設置(兩步法)(以Bio-Rad公司CFX 96 qPCR儀、軟件版本4.1.2433.1219為例)

    1. 創建空白新程序,選擇絕對定量檢測模板。

    2. 創建1個檢測探針,命名為“CHO-DNA”,選擇“run setup”欄中的“select run type”下方的“user-define”,在“run setup”界面中開始程序、板位、通道的設置:

    2.1 首先,“protocol”下點擊“Create New”開始設置PCR程序,設置好后點擊“OK”,保存程序文件。

    2.2 點擊“Next”或者“plate”進入孔位設置界面,點擊“create new”,“Scan Mode”中可以選擇“All Channels”或者“SYBR/FAM Only”選項。用鼠標勾選反應格,點擊“select fluorophores”選項,勾選“FAM”后點擊“OK”,在“sample type”選項下選擇“unknow”(或其他樣本類型),勾選“target name欄下的“load”右邊的框,同時根據個人需求設置“target name”,也可不設置。根據個人需求在選項“Sample names”和“Biological Group”中輸入樣本名稱和組別,也可不設置。點擊“OK”保存好最后的結果文件。

    2.3 點擊“Next”或“Start run”,開始儀器運行。

    3. 擴增程序設置:設置反應體積40 μL。

    循環步驟

    溫度(℃)

    時間

    循環數

    預變性

    95 ℃

    5 min

    1

    變性

    95 ℃

    15 sec

    40

    退火/延伸(收集熒光)

    60 ℃

    30 sec

    、qPCR 結果分析

    1. 上機結束后,在程序的右上角點擊“plate setup” 欄下的“view/edit plate”,選中標準品的反應格,在右側的“sample type”欄下選擇“standard”,設置好每個梯度的重復孔,在“loda concentration”下輸入所做的濃度后按“enter”鍵確認,依次將標準品的梯度設置完成。

    2. 點擊“OK”,返回到初始界面,即可讀取標準曲線R²、擴增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)。正常的標曲R²>0.99;擴增效率在90%≤Eff%≤110%范圍內;Slope在3.4左右。

    3. 根據設置樣本名稱和組別,讀取無模板對照NTC、陰性質控NCS、待測樣本和樣本加標回收的檢測值,單位為fg/μL,后續可在檢測報告中將單位換算成pg/μL或pg/mL。

     

    HB220518

     

    400-6111-883

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