產品信息

產品描述

Hieff^? Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit 適用于對各種動物細胞進行RNA提?。ㄈ?/span>cell line 化的貼壁細胞和懸浮細胞、原代培養細胞、各種干細胞、iPS 細胞等），無需提RNA，可直接進行qPCR表達分析，用時短，操作簡單，出錯率低，最短只需1.5小時就可高效完成從模板制備到反轉錄反應及基因表達分析等步驟。

試劑盒中包含反轉錄以及熒光檢測試劑，無需另外購買，可輕松地進行基因表達分析。

產品組分

運輸與保存方式

FCD Lysis Buffer 和 FCD Washing Buffer融解后置于4℃保存，注意防止污染。FCD Stop Solution、DNase I、4×Hieff^? FCD RT Mix和2×Hieff^? FCD qPCR SYBR Master Mix長期保存時請于-20℃放置。有效期6個月。

需自備的試劑及耗材

無核酸酶污染的槍頭及離心管。

注意事項：

1）使用前，將凍存的各組分充分融解并輕輕混勻后使用。

2）實驗時，請盡量使用無污染的耗材，避免污染。

3）本產品避免反復凍融，配制時應避免強光照射。

4）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

5）本產品僅作科研用途！

操作步驟

一、裂解產物的制備

1. 將試劑放置于室溫下融化，使用前上下顛倒，輕輕混勻，并輕微離心后使用，避免產生氣泡。

【注】：沒有完全混勻試劑、未在冰上配置試劑等會導致反應性能下降。

2. 根據細胞類型，將細胞轉移至離心管中，5000 rpm離心2 min收集細胞，充分吸除培養基。若細胞在96孔板中培養，可直接吸除培養基。

3. 各個孔內加入FCD Washing Buffer 150 μL，吸打清洗細胞，5000 rpm離心2 min，吸盡FCD Washing Buffer。

4. 各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液，2 μL DNase Ⅰ溶液，室溫吸打混勻后靜置5分鐘，孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution, 吸打混勻 5 次左右，即可得到裂解產物。

【注】：a) 細胞數的基本要求是每孔 1 × 10⁴ cells, 該試劑盒可以使用的范圍是 1 × 10³ - 1 × 10⁶ cells。若細胞數量較多，可適當等比例增加FCD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。

b) 50 μL的裂解液對應加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依實驗需要，加入裂解液量增大時需相應增大FCD Stop Solution的量。

c) 不同細胞的離心條件不同，請使用適合于所用細胞的離心速度進行離心。

d) 細胞裂解產物溶液長期保存時，請置于-20℃。

5. 室溫融化4× Hieff^? FCD RT Mix后輕微顛倒混勻，置于冰上并按下表配置反應體系：

*推薦使用量為2-5 μL，盡量不超過45%。

二、反轉錄

移液器輕輕混勻上述配制的反應液，按下表程序進行反轉錄反應：

【注】：反轉錄溫度推薦使用55℃，對于高GC含量模板或者復雜模板，可將反轉錄溫度提高到 60℃。反轉錄產物可直接進行下游RT-qPCR檢測。為避免反轉錄體系對qPCR反應的抑制，得到合適的Ct值（10-35），可將產物稀釋10-1000倍后使用。若短時間內不進行下游實驗，可放置于-20℃保存。

三、熒光定量PCR

a. 體系配置

推薦使用下列組份比例配制反應液（配制過程請于冰上進行）:

【注】：若反轉錄產物未進行稀釋，反轉錄產物的加入量不要超過RT-qPCR體積的1/10，高濃度模板易導致非特異擴增。若反轉錄產物適當稀釋5-50倍，模板推薦用量4 μL，盡量不要超過6 μL。反應性能較差時，可以在0.2-1.0 μM范圍內調整引物濃度。
建議采用下面的 Shuttle PCR 標準操作流程進行 PCR 反應。必要時進行 PCR 反應條件的優化。使用Tm值較低的引物等進行Shuttle PCR難以擴增時，進行三步法 PCR 擴增反應。

b. 熒光定量PCR擴增程序（兩步法）

c. 熒光定量PCR快速擴增程序（兩步法）

【注】：退火/延伸溫度、終延伸時間可根據實驗要求適當調整。 快速程序適用于絕大多數基因，個別復雜二級結構基因可嘗試標準程序。

d. 熒光定量PCR擴增程序（三步法）

HB220926