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    復制型慢病毒(RCL)檢測試劑盒

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    產品說明書

    FAQ

    COA

    已發表文獻

    產品信息

     

    產品名稱

    產品編號

    規格

    價格(元)

    Replication-competent Lentivirus (RCL) Detection Kit

    復制型慢病毒(RCL)檢測試劑盒

    41311ES50

    50T

    8,895.00

    41311ES60

    100T

    16,425.00

     

    產品描述

     

    復制型慢病毒(RCL)檢測試劑盒用于定量分析檢測各種使用慢病毒載體相關的細胞產品中可能發生的復制型慢病毒的潛在風險。
    本試劑盒針對包膜質粒VSV-G序列設計定量引物,采用qPCR熒光探針原理,專一快速的檢測復制型慢病毒RCL,其最低檢測限可以達到1 copiesL水平配套有RCL DNA ControlDNA定量參考品。試劑盒需要與本公司的磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。

     

    產品組分

     

    組分編號

    組分名稱

    產品編號/規格

    41311ES50 (50T)

    41311ES60 (100T)

    41311-A

    RCL qPCR Mix

    0.75 mL

    1.5 mL

    41311-B

    RCL Primer&probe Mix

    200 μL

    400 μL

    41311-C

    DNA Dilution Buffer

    2×1.8 mL

    4×1.8 mL

    41311-D

    RCL DNA Control (5×108 copies/μL)

    25 μL

    50 μL

    41311-E

    IC

    50 μL

    100 μL

     

    運輸和保存方法

     

    1. 所有組分均干冰運輸,-20℃保存,有效期2年。

    2. 收到貨后,請檢查共5個組分是否齊全,并立即放入對應的保存溫度中儲存。

     

    注意事項

     

    1. 使用本試劑前請仔細閱讀本說明書,實驗應規范操作,包括樣本處理、反應體系的配制及加樣。

    2. 每個組分在使用前都應充分震蕩混勻,低速離心。

    3. 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

    4. 本產品僅作科研用途。

     

    適用機型 

     

    包含但不限于以下儀器:

    Bio-RadCFX96 Optic Module;

    Thermo ScientificABI 7500,ABI Quant Studio 5,ABI Step OnePlus;

    上海宏石醫療科技:SLAN-96S。

     

    使用方法

     

    一、RCL DNA定量參考品的稀釋和標準曲線的制備

    用試劑盒中提供的DNA Dilution BufferDNA稀釋液RCL DNA Control定量參考品進行梯度稀釋,稀釋濃度依次為5×106copies/μL、5×105copies/μL、5×104copies/μL、5×103copies/μL、5×102copies/μL、5×101copies/μL。

    具體操作如下:

    1. 將試劑盒中的RCL DNA ControlDNA Dilution Buffer置于冰上融化,待完全融化后,輕微振蕩混勻,低速離心10 sec。

    2. 7支干凈的1.5 mL離心管,分別標記為Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5、Std6。

    3. 在標記為Std01.5 mL離心管中加90 μL DNA Dilution Buffer10 μL RCL DNA Control,即稀釋為5×107copies/μL,振蕩混勻后短時間快速離心10 s,該濃度可分裝置于-80℃期保存(不超過3個月),使用時避免反復凍融。

    4. Std1、Std2、Std3、Std4、Std5、Std6管中先分別加入90 μL DNA Dilution Buffer,再進行梯度稀釋,稀釋方法如下:

    稀釋管

    稀釋比例

    終濃度

    Std1

    10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer

    5×106copies/μL

    Std2

    10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer

    5×105copies/μL

    Std3

    10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer

    5×104copies/μL

    Std4

    10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer

    5×103copies/μL

    Std5

    10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer

    5×102copies/μL

    Std6

    10 μL Std5 + 90 μL DNA Dilution Buffer

    5×101copies/μL

    【注】

    1. 每個濃度做3個復孔,該試劑可測試5×106copiesL-5×101copiesL線性范圍。需要,可適當擴大縮小線性范圍。

    2. 為減少反復凍融次數和避免污染,建議初次使用時將DNA定量參考品分裝儲存于-80℃。

    3. 已融化未使用的DNA稀釋液可保存于2-8℃ 7天,長時間不用,請放置于-20℃。

    4. 為確保模板完全混勻,每個梯度稀釋時需輕微震蕩混勻1 min。

     

    二、樣本回收質控ERC的制備

    根據需要設ERC中的RCL DNA標準品濃度(以制備加5×104copies RCL DNAERC為例),具體操作如下

    1. 100 μL待測樣本加入1.5 mL凈的離心管中,再加入10 μL Std4,混勻,標記為ERC。

    2. 回收ERC和同批待測樣本一起進行樣本前處理,制備回收ERC純化液。

     

    、陰性抽提質控NCS的制備

    根據實驗設置陰性抽提質控NCS,具體操作如下:

    1. 100 μL樣本基質溶液DNA稀釋液加入1.5 mL凈的離心管中,標記為NCS。

    2. 陰性質控NCS和同批待測樣本一起進行樣本前處理,制備成陰性質控NCS純化液。

     

    、無模板對照NTC的制備

    根據實驗設置無模板對照NTC,具體操作如下:

    1. 無模板對照NTC無需進行樣本前處理,qPCR法檢測殘留DNA含量階段開始配置即可。

    2. 每管或孔中的NTC反應體系為20 μL Mix混合液(即15 μL RCL qPCR Mix + 4μL RCL Primer&Probe Mix+ 1μL IC+ 10 μL DNA Dilution Buffer,建議配置3個重復孔的量。

     

    五、反應體系

    組分

    體積(μL

    RCL qPCR mix

    15

    RCL Primer&probe mix

    4

    DNA template

    10

    IC

    1

    總體積

    30

    【注】

    1. 根據反應孔數計算本次所需的Mix混合液總量:Mix混合液=(反應孔數+2× (15+4+1) μL(含有2孔的損失量)。通常,每個樣本做3個重復孔。

    2. 反應孔數=6個濃度梯度的標準曲線+1個無模板對照NTC+1個陰性抽提質控NCS+待測樣TS個數+待測樣本對應加標回收ERC個數)× 3。

    NTC (No Template Control)DNA Dilution Buffer

    NCS (Negative Control Solution)樣本基質溶液或DNA Dilution Buffer進行樣本前處理,所得純化液為NCS

    TS (Test Sample)待測樣本

    ERC (Extraction Recovery Control)待測樣本中加入如5×104copies標準品DNA后進行樣本前處理,所得純化液為加標回收ERC

    3. 加樣完成密封好管子后,請低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底,再震蕩混勻5 sec以上,完全混勻反應液,再低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底,如有氣泡,需將氣泡排盡。

    下圖為參考板位:

    image.png

    該示例是對RCLqPCR法檢測操作的展示,檢測樣本包括:6個濃度梯度的RCL DNA標準曲線、1個無模板對照NTC、1個陰性質控NCS、3個待測樣本TS、3樣本回收ERC。建議每個樣本3個重復孔。

     

    六、擴增程序參數設置(兩步法)(以ABI公司7500 qPCR儀、軟件版本2.0為例)

    1. 創建空白新程序,選擇絕對定量檢測模板。

    2. 創建1個檢測探針,命名為RCL-DNA,選擇報告熒光基團為FAM,猝滅熒光基團為none;創建1個檢測探針,命名為IC,選擇報告熒光基團為CY5,猝滅熒光基團為none。參比熒光為ROX參比熒光可根據儀器型號等情況,選擇是否需要添加)。

    3. Assign target (s) to the selected wells面板中,將標準曲線孔的Task一欄設置為Standard,并且在Quantity一欄分別賦值為5000000、500000、50000、5000、500、50(含義為每孔的DNA濃度,單位為copies/μL),并且在相應的sample name一欄中命名為5×106copies/μL、5×105copies/μL、5×104copies/μL、5×103copies/μL、5×102copies/μL、5×101copies/μL;將無模板對照NTC孔的Task一欄設置為NTC;將陰性質控NCS孔、待測樣本TS孔、樣本加標回收ERC孔的Task一欄設置為Unknown,并且在相應的Sample Name一欄中分別命名為NCS、TS、ERC,之后點擊Start Run,開始儀器運行。

    4. 擴增程序設置:設置反應體積30 μL。

    循環步驟

    溫度(

    時間

    循環數

    污染消化

    37℃

    5min

    1

    預變性

    95℃

    5min

    1

    變性

    95℃

    15 sec

    45

    退火/延伸(收集熒光)

    60℃

    30 sec

     

    七、qPCR 結果分析

    1. AnalysisAmplification Plot面板中,系統會自動給出Threshold,有時系統給出的Threshold離基線太近,導致復孔之間Ct相差甚遠,可手動調節Threshold至合適位置,點擊Analyze。此時可在Multicomponent Plot初步查看擴增曲線的形態是否正常。

    2. AnalysisStandard Curve面板中,可讀取標準曲線的、擴增效率(Eff%、斜率(Slope)、截距(Intercept。正常的標曲0.99,擴增效率在90%≤Eff%≤110%范圍內,Slope-3.6~-3.1。

    3. AnalysisView well table面板中,Quantity一欄可讀取無模板對照NTC、陰性質控NCS、待測樣本TS、樣本加標回收ERC的檢測值,單位為copies/μL,后續可在檢測報告中進行單位換算。

    4. 結果分析的參數設置需依據具體的機型及使用的軟件版本,一般也可由儀器自動判讀。

    5. 根據待測樣本TS和樣本加標回收ERC的檢測結果計算加回收率,加回收率要求在50%150%之間。加標回收率計算公式:回收率(%) = {本加標測定值(fg/µL)-測定值(fg/µL)洗脫體積(µL) / DNA加入量理論值×100%。

    6. 陰性質控NCSCt值應大于標曲最低濃度Ct均值。

    7. 無模板對照NTC的檢測結果應為UndeterminedCt38。

    HB221017

    400-6111-883

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