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    SV40LTA&E1A Residue DNA Detection Kit SV40LTA&E1A 殘留 DNA 檢測試劑盒

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    產品說明書

    FAQ

    COA

    已發表文獻

    產品信息

     

    產品名稱

    產品編號

    規格

    價格

    SV40LTA&E1A Residue DNA Detection Kit

    SV40LTA&E1A殘留DNA檢測試劑盒

    41310ES50

    41310ES60

    50T

    100T

    8,895

    16,425

     

    產品描述

     

    SV40LTA&E1A殘留DNA檢測試劑盒是用于定量分析檢測生物制品中宿主細胞,如HEK293T細胞系中的SV40LTAE1A殘留DNA含量的試劑盒。

    本試劑盒采用探針法熒光定量PCR原理,專一快速的檢測樣品中SV40LTAE1A殘留DNA,其最低檢測限可以達到101 copies/μL水平。試劑盒本公司的磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。

     

    產品組分

     

    組分編號

    組分名稱

    產品編號/規格

    41310ES50 (50T)

    41310ES60 (100T)

    41310-A

    SV40LTA&E1A qPCR Mix

    0.75 mL

    1.5 mL

    41310-B

    SV40LTA&E1A Primer&Probe Mix

    200 μL

    400 μL

    41310-C

    DNA Dilution Buffer

    2×1.8 mL

    4×1.8 mL

    41310-D

    SV40LTA&E1A DNA Control

    25 μL

    50 μL

    41310-E

    IC

    50 μL

    100 μL

     

    運輸和保存方法

     

    1. 所有組分均干冰運輸,-20℃保存,有效期2年。

    2. 收到貨后,請檢查共5個組分是否齊全,并立即放入對應的保存溫度中儲存。

     

    注意事項

     

    1. 使用本試劑前請仔細閱讀本說明書,實驗應規范操作,包括樣本處理、反應體系的配制及加樣。

    2. 每個組分在使用前都應充分震蕩混勻,低速離心。

    3. 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

    4. 本產品僅作科研用途。

     

    適用機型

     

    包含但不限于以下儀器:

    Bio-RadCFX96 Optic Module;

    Thermo ScientificABI 7500,ABI Quant Studio 5,ABI Step OnePlus;

    上海宏石醫療科技:SLAN-96S。

     

    使用方法

     

    一、SV40LTA&E1A定量參考品的稀釋和標準曲線的制備

    SV40LTA&E1A定量參考品內含有SV40LTA的濃度為2.80×108 copies/μL,E1A的濃度為2.70×108 copies/μL。

    具體操作如下:

    1. 將試劑盒中的DNA定量參考品DNA稀釋液置于冰上融化,待完全融化后,輕微振蕩混勻,低速離心10 sec。

    2. 6支干凈的1.5 mL離心管,分別標記為Std0,Std1,Std2,Std3,Std4,Std5。

    3. 在標記為Std01.5 mL離心管中加90 μL DNA Dilution Buffer10 μL SV40LTA&E1A DNA Control,SV40LTA&E1A定量參考品稀釋10倍,得到Std0SV40LTA濃度2.80×107 copies/μL,E1A濃度2.70×107 copies/μL,振蕩混勻后短時間快速離心10 sec,該濃度可分裝置于-20℃期保存(不超過3個月),使用時避免反復凍融。

    4. Std1,Std2,Std3,Std4,Std5管中先分別加入90 μL DNA稀釋液,再進行梯度稀釋,稀釋方法如下:

    稀釋管

    稀釋比例

    終濃度(copies/μL)

    SV40LTA

    E1A

    Std1

    10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer

    2.80×106

    2.70×106

    Std2

    10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer

    2.80×105

    2.70×105

    Std3

    10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer

    2.80×104

    2.70×104

    Std4

    10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer

    2.80×103

    2.70×103

    Std5

    10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer

    2.80×102

    2.70×102

    【注】

    1. 每個濃度做3個復孔,該試劑可測試2.80×102-2.80×106 copies/μL線性范圍SV40LTA和對應的2.70×102-2.70×106 copies/μL線性范圍E1A。

    2. 為減少反復凍融次數和避免污染,建議初次使用時將DNA定量參考品分裝儲存于-20℃。

    3. 已融化未使用的DNA稀釋液可保存于2-8℃ 7天,長時間不用,請放置于-20℃。

    4. 為確保模板完全混勻,每個梯度稀釋時需輕微震蕩混勻1 min。

     

    二、樣本回收質控ERC的制備

    根據需要設ERC中的SV40LTA&E1A DNA標準品濃度(以制備加2.80×104 copies SV40LTA對應2.70×104 copies E1A DNAERC為例),具體操作如下

    1. 100 μL待測樣本加入1.5 mL凈的離心管中,再加入10 μL Std4,混勻,標記為ERC。

    2. 回收ERC和同批待測樣本一起進行樣本前處理,制備回收ERC純化液。

     

    、陰性抽提質控NCS的制備

    根據實驗設置陰性抽提質控NCS,具體操作如下:

    1. 100 μL樣本基質溶液DNA Dilution Buffer加入1.5 mL凈的離心管中,標記為NCS。

    2. 陰性質控NCS和同批待測樣本一起進行樣本前處理,制備成陰性質控NCS純化液。

     

    、無模板對照NTC的制備

    根據實驗設置無模板對照NTC,具體操作如下:

    1. 無模板對照NTC無需進行樣本前處理,qPCR法檢測殘留DNA含量階段開始配置即可。

    2. 每管或孔中的NTC反應體系為20 μL Mix混合液(即15 μL SV40LTA&E1A qPCR Mix + 4μL SV40LTA&E1A Primer&Probe Mix+ 1μL IC+ 10 μL DNA Dilution Buffer,建議配置3個重復孔的量。

     

    五、反應體系

    組分

    體積(μL

    SV40LTA&E1A qPCR Mix

    15

    SV40LTA&E1A Primer&Probe Mix

    4

    DNA template

    10

    IC

    1

    總體積

    30

     

    【注】

    1.根據反應孔數計算本次所需Mix混合液總量:Mix混合液=(反應孔數+2× (15+4+1) μL(含有2孔的損失量)。通常,每個樣本做3個重復孔。

    2. 反應孔數=5個濃度梯度的標準曲線+1個無模板對照NTC+1個陰性抽提質控NCS+待測樣TS個數+待測樣本對應加標回收ERC個數)× 3。

    NTC (No Template Control)DNA Dilution Buffer

    NCS (Negative Control Solution)樣本基質溶液或DNA Dilution Buffer進行樣本前處理,所得純化液為NCS

    TS (Test Sample)待測樣本

    ERC (Extraction Recovery Control)待測樣本中加入如2.80×104 copies SV40LTA對應2.70×104 copies E1A標準品DNA后進行樣本前處理,所得純化液為加標回收ERC

    3. 加樣完成密封好管子后,請低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底,再震蕩混勻5 sec以上,完全混勻反應液,再低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底,如有氣泡,需將氣泡排盡。

    下圖為參考板位:

    該示例是對SV40LTA&E1A殘留DNA qPCR法檢測操作的展示,檢測樣本包括:5個濃度梯度SV40LTA&E1A DNA標準曲線、1個無模板對照NTC、1個陰性質控NCS、3個待測樣本TS、3樣本回收ERC。建議每個樣本3個重復孔。

     

    六、擴增程序參數設置(兩步法)(以ABI公司7500 qPCR儀、軟件版本2.4為例)

    1.創建空白新程序,選擇絕對定量檢測模板。

    2.創建2個檢測探針,第一個命名為SV40LTA-DNA,選擇報告熒光基團為FAM,猝滅熒光基團為none;第二個命名為E1A-DNA,選擇報告熒光基團為VIC,猝滅熒光基團為none;創建1個檢測探針,命名為IC,選擇報告熒光基團為CY5,猝滅熒光基團為none。參比熒光為ROX參比熒光可根據儀器型號等情況,選擇是否需要添加)。

    3.在Assign target (s) to the selected wells面板中,將標準曲線孔Task一欄設置為Standard,并且在Quantity一欄分別賦值FAM通道2800000、280000、28000、2800、280,VIC通道2700000、270000、27000、2700、270(含義為每孔的DNA濃度,單位為copies/μL),并且在相應的sample name一欄中命名為Std1、Std2、Std3、Std4、Std5;將無模板對照NTC孔的Task一欄設置為NTC;將陰性質控NCS孔、待測樣本TS孔、樣本加標回收ERC孔的Task一欄設置為Unknown,并且在相應的Sample Name一欄中分別命名為NCS、TS、ERC,之后點擊Run Method設置擴增程序(程序設置如4.所示),程序設置好點擊Start Run,開始儀器運行。

    4. 擴增程序設置:設置反應體積30 μL。

    循環步驟

    溫度(

    時間

    循環數

    預變性

    95℃

    5 min

    1

    變性

    95℃

    15 sec

    40

    退火/延伸(收集熒光)

    60℃

    30 sec

     

    七、qPCR 結果分析

    1.在AnalysisAmplification Plot面板中,系統會自動給出Threshold,有時系統給出的Threshold離基線太近,導致復孔之間Ct相差甚遠,可手動調節Threshold至合適位置,點擊Analyze。此時可在Multicomponent Plot初步查看擴增曲線的形態是否正常。

    2. AnalysisStandard Curve面板中,可讀取標準曲線的斜率(Slope)、截距(Intercept)、、擴增效率(Eff%)。正常的標曲0.99,擴增效率在90%≤Eff%≤110%范圍內,Slope-3.6~-3.1。

    3. AnalysisView well table面板中,Quantity一欄可讀取無模板對照NTC、陰性質控NCS、待測樣本TS、樣本加標回收ERC的檢測值,單位為copies/μL,后續可在檢測報告中進行單位換算。

    4. 結果分析的參數設置需依據具體的機型及使用的軟件版本,一般也可由儀器自動判讀。

    5. 根據待測樣本TS和樣本加標回收ERC的檢測結果計算加回收率,加回收率要求在50%~150%之間。加標回收率計算公式:回收率(%) = {本加標測定值(copies/µL)-測定值(copies/µL)洗脫體積(µL) / DNA加入量理論值×100%。

    6. 陰性質控NCSCt值應大于標曲最低濃度Ct均值。

    7. 無模板對照NTC的檢測結果應為UndeterminedCt≥35。

    HB221026

    400-6111-883

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