產品描述

 

Protein A純化介質由于與大多數抗體有特異性吸附，因此被廣泛地用于抗體藥物生產過程中，其中Protein A通過共價鍵與純化介質結合，但在純化過程中Protein A有一定脫落幾率而殘留下來。Protein A ELISA Kit是一款能夠準確定量樣品中殘留Protein A的ELISA試劑盒，可用于抗體純化過程中的工藝優化、關鍵質量參數評價以及中間產品和終產品中的Protein A殘留量檢測。

本試劑盒應用雙抗夾心酶聯免疫檢測（ELISA）的實驗原理進行Protein A殘留量檢測，將Protein A標準品和待測樣品加入預包被抗Protein A抗體的Protein A捕獲微孔板條（36716-A），然后加入稀釋后的生物素標記的Protein A檢測抗體（36716-C），最后加入Streptavidin-HRP（SA-HRP）（36716-D），形成抗體+抗原+抗體‐Biotin+ SA‐HRP 復合物，洗板后加入TMB顯色液（36716-F）顯色。TMB在HRP酶的催化下由無色轉化成藍色并在終止液（36716-G）的作用下最終轉換成黃色。黃色的深淺與樣品中被檢測到的Protein A的量呈正相關。

 

產品組分

 

編號	組分	產品編號/規格
		36716ES96 (96 T)
36716-A	Protein A捕獲微孔板條	1塊（8孔×12條）
36716-B	Protein A標準品（1 μg/mL）	100 μL
36716-C	Protein A檢測抗體（80×）	300 μL
36716-D	Streptavidin-HRP（500×）	60 μL
36716-E	吐溫-20（10%）	1 mL
36716-F	TMB顯色液	12 mL
36716-G	終止液	10 mL
36716-H	稀釋液1（5×）	10 mL
36716-I	稀釋液2	50 mL
36716-J	濃縮洗液（20×）	50 mL
36716-K	封板膜	5 張

【注】：

1. 36716-H稀釋液1（5×）用于標準品和樣品的稀釋；

2. 36716-I稀釋液2用于檢測抗體和Streptavidin-HRP的稀釋；

 

運輸儲存方法

 

1. 冰袋運輸。2-8℃保存，有效期12個月；

2. 收到貨后，請檢查各組分是否齊全，并立即放入對應的保存溫度中儲存；

3. 請在有效期內使用該產品，禁止不同批次的相關試劑進行混用。

 

注意事項

 

1. 使用本試劑前請仔細閱讀本說明書，實驗應規范操作，包括樣本處理、反應時間控制及加樣操作；

2. 每個組分在使用前都應混勻，低速離心；

3. 所有試劑在打開之前，需要置于室溫至少30分鐘；

4. 貼壁加樣，保證不同管/孔間加樣體積一致，建議潤洗吸頭；

5. 洗板后向孔板加樣前，需要確保板內洗液已被拍除干凈；

6. 每步向孔板中加樣前，需確?？變葻o可見異物；

7. 吸取不同液體前，需要更換新的吸頭；

8. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作；

9. 避免終止液和顯色液接觸皮膚、眼睛或衣服，建議佩戴護目鏡；

10. 本產品僅作科研用途。

 

適用機型

 

包含但不限于以下儀器：

Molecular Devices：M和i系列

 

實驗前準備

 

一、本試劑盒未提供但實驗所需的實驗材料：

1. 量筒、1000mL燒杯、不同規格的EP管；

2. 無塵紙（用于洗板后拍板）；

3. 無菌吸頭；

4. 樣品前處理板；

5. 去離子水或雙蒸餾水；

 

二、本試劑盒未提供但實驗所需的實驗設備和儀器：

1. 金屬浴/水浴鍋

2. 37℃恒溫箱

3. 全自動洗板機

4. 旋渦混勻儀、離心機

5. 不同規格的精密微量移液器、多通道微量移液器

6. 計時器、4℃冰箱

7. 能夠檢測450nm和630nm吸光度的酶標儀；

 

實驗方法

 

一、試劑、抗體準備：

1. 1×洗液

根據所需的量，用去離子水或雙蒸水按1:20的比例，將濃縮洗液（20×）稀釋20倍，最終得到1×洗液。

舉例：取50 mL的濃縮洗液（20×）加入950 mL的去離子水中配成1000 mL 1×洗液。 

【注】：如果濃縮洗液（20×）中出現結晶，在50℃的水浴鍋中溫浴，直至結晶完全消失。

2. 1×樣品稀釋液（稀釋液1用于樣品和標準品的稀釋）

根據所需的量，用去離子水或雙蒸水按1:5的比例，將稀釋液1（5×）稀釋5倍，最終得到1×樣品稀釋液。

【注】：如果稀釋液1（5×）中出現結晶，在50℃的水浴鍋中溫浴，直至結晶完全消失。

3. 1×Protein A檢測抗體工作液

根據檢測所需的量用稀釋液2按照1:80的比例，將Protein A檢測抗體（80×）稀釋至1×。

4. 1×HRP工作液

根據所需的量，用稀釋液2按照1：500的比例，將HRP濃縮液（500×）稀釋至1×。

二、Protein A標準品溶液制備

提前準備9個1.5mL離心管，參照下表，分別加入對應體積的1×稀釋液1。隨后參照下表稀釋步驟依次制備標準品500 pg/mL、250 pg/mL、125 pg/mL、62.5 pg/mL、31.25 pg/mL、15.625 pg/mL、7.813 pg/mL和0 pg/mL。注意各濃度標準品需要設置復孔。

表1 Protein A標準品溶液制備

管號	標準品濃度	移取	1×稀釋液1	標準品終濃度
1	1 μg/mL標準品（36716-B）	5 μL	995 μL	5 ng/mL
2	5 ng/mL 標準品（管1）	100 μL	900 μL	500 pg/mL
3	500 pg/mL標準品（管2）	500 μL	500 μL	250 pg/mL
4	250 pg/mL標準品（管3）	500 μL	500 μL	125 pg/mL
5	125 pg/mL的標準品（管4）	500 μL	500 μL	62.5 pg/mL
6	62.5 pg/mL的標準品（管5）	500 μL	500 μL	31.25 pg/mL
7	31.25 pg/mL的標準品（管6）	500 μL	500 μL	15.625 pg/mL
8	15.625 pg/mL的標準品（管7）	500 μL	500 μL	7.813 pg/mL
9	1×樣品稀釋液	/	500 μL	0 pg/mL

 

三、樣品準備

1.需要將樣品蛋白濃度稀釋至10mg/mL以下，較高的抗體濃度可能會干擾檢測的準確度；

2.樣品PH值調整到6.0-7.5的范圍；

3.注意各待測樣品需要設置復孔。

四、樣本和標準品處理

由于脫落的Protein A可以結合抗體的Fc區，抗體-Protein A復合體會影響對Protein A的檢出，所以實驗前需要先將Protein A和抗體分開，本產品中使用加熱方式進行Protein A和抗體分離。加熱變性以后，抗體經過離心后沉淀，Protein A留于上清液中。具體實驗步驟如下：

1.向離心管中加入不低于500 μL的待測樣本和標準品（500 pg/mL、250 pg/mL、125 pg/mL、62.5 pg/mL、31.25 pg/mL、15.625 pg/mL、7.813 pg/mL和0 pg/mL）；

2.每個樣本中加入1%體積的吐溫‐20（10%）（36716-E）至終濃度為0.1%，混勻；

3.將離心管置于金屬浴100℃或者沸水中保持10分鐘；

4.室溫冷卻，11,000 rpm離心5分鐘；

5.將含有Protein A的上清液轉移至新的離心管中并做好標記。

【注】：若待測樣品中Protein A濃度較高，用1×稀釋液1稀釋至標準曲線范圍內再進行檢測。

 

實驗步驟

 

1.樣品孵育：

1）從鋁箔袋中取出需要的Protein A 捕獲微孔板條，剩余板條密封好放回2-8℃保存。確保板條已在孔板架上固定好。

2）將預處理好的待測樣品以及Protein A標準品（500 pg/mL、250 pg/mL、125 pg/mL、62.5 pg/mL、31.25 pg/mL、15.625 pg/mL、7.813 pg/mL和0 pg/mL）各100 μL加入對應板孔中。

3）用封板膜封板，37℃孵育60分鐘。

4）洗板：移去封板膜，棄去板孔中液體，每孔加入1×洗液250 μL，浸泡30秒，棄去洗液，重復洗滌4次。

【注】：本步驟可以在洗板機上完成。如用洗板機，請設置潤洗，洗液體積不少于250 μL，吸液時間不少于0.8秒，浸泡時間不少于10秒，重復洗滌4次。

5）在無塵紙上拍板，將板孔中的殘留液體拍干。

2. Protein A檢測抗體孵育

1）向每孔中各加入1×Protein A檢測抗體工作液100 μL。

2）用封板膜封板，37℃孵育60分鐘。

3）洗板，同第1節“樣品孵育”中的步驟4）。

4）在無塵紙上拍板，將板孔中的殘留液體拍干。

3. Streptavidin-HRP（SA-HRP）孵育

1）每孔加入Streptavidin-HRP （SA-HRP）100 μL。

2）用封板膜封板，37℃孵育40分鐘。

3）洗板，同第1節“樣品孵育”中的步驟4）。

4）在無塵紙上拍板，將板孔中的殘留液體拍干。

4. TMB反應和吸光值檢測

1）每孔加入TMB顯色液100 μL。

2）用封板膜封板，37℃避光反應15分鐘。

3）移去封板膜，每孔加入終止液50 μL。

4）終止后10分鐘內用酶標儀在450 nm與630 nm處測量吸光值。校準后的OD值為450nm的測定值減去630nm的測定值（OD_450nm-OD_630nm）。僅用450nm的測定值會導致OD值偏高，并且準確度降低。

5）以OD值為縱坐標，Protein A標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，根據標準曲線計算出樣品中Protein A的濃度。

6）典型的參考標準曲線如下（僅供參考，每次實驗都需要制備標準曲線）：

標準品濃度（pg/mL）	校準OD值
	重復1	重復2	均值	擬合值
500	3.056	3.094	3.075	3.075
250	2.217	2.286	2.252	2.256
125	1.465	1.481	1.473	1.459
62.5	0.840	0.840	0.840	0.855
31.25	0.468	0.474	0.471	0.477
15.625	0.284	0.277	0.281	0.269
7.8125	0.168	0.170	0.169	0.162
0	0.052	0.052	0.052	0.060

 

【注】：擬合值是指把標準品濃度（X）帶入標準曲線公式得到的OD值（Y）。

5. 檢測流程圖

 

 

產品性能

 

一、精密度

本試劑盒批內差小于10%，批間差小于15%。

批內差			批間差
檢測數	均值	變異系數(%)	檢測數	均值	變異系數(%)
10	467.387	1.8%	10	474.357	2.4%
10	109.442	1.9%	10	108.343	3.6%
10	31.212	6.9%	10	30.597	14.5%

二、靈敏度

本試劑盒的最低檢測限（LOD）和最低定量限（LOQ）如下表:

樣本類型	LOD	LOQ
重組Protein A	3.1 pg/mL	15.6 pg/mL

三、專屬性和回收率

向0.5 mg/mL IgG中加入不同濃度的protein A，同時檢測未加標的0.5 mg/mL IgG樣本。未加標的0.5 mg/mL IgG樣本檢測值小于定量限，加標樣本的回收率在85%-115%之間。

加入標準品濃度（pg/mL）	0.5 mg/mL IgG 添加標準品
	重復1	重復2	平均OD	實測值	回收率
500.000	3.263	3.262	3.263	468.6	93.72%
125.000	1.689	1.773	1.731	123.8	99.04%
31.250	0.584	0.581	0.583	34.70	111.00%
0	0.061	0.064	0.063	< LOD	-

 

常見問題

 

問題	原因	解決方法
標準曲線不好	移液量不準確導致個別濃度不準確	對移液器進行校正；2. 保持加樣速度，避免吸打過快造成吸頭內壁殘留；3. 保持不同管間加樣一致；4. 潤洗吸頭
	稀釋方法不恰當導致濃度不準	提前將稀釋液加入各管內；2. 注意每步充分混勻；3. 保持不同管間加樣一致
	試劑未完全恢復至室溫導致OD偏低	使用前，需在室溫放置至少30mins，保證試劑都恢復室溫
	漏加或誤用其他試劑導致沒有梯度出現	使用前再將對應試劑拿出（但需確保已恢復室溫）；2. 將不同試劑進行標記或分開放置，避免拿錯試劑
重復性差	復孔中只有1個孔加了樣品	建議使用樣品前處理板，提前將樣品加好，再使用多通道移液器將液體轉移到微孔板條中
	孔中有異物	每次加樣和讀板前檢查板底，確?？變葻o異物
	加樣不準	潤洗吸頭；2. 使用多通道移液器加樣；3. 沿孔壁勻速加入液體
	洗板操作不當	確保各孔都被添加了足夠的洗液；2. 如果使用洗板機，檢查出液孔是否堵塞
OD值偏低	孵育時間太短	使用計時器，隨時注意實驗時間
	移液量不足或稀釋不當	注意移液器是否在校準有效期內，是否有故障；2. 提前記錄好稀釋體積，按照記錄操作，保證移液一致性
	漏加或誤用其他試劑	使用前再將對應試劑拿出（但需確保已恢復室溫）；2. 將不同試劑進行標記或分開放置，避免拿錯試劑
	TMB顯色液光下暴露時間過長已顯淺藍色	更換顯色液
	沒有立即讀板	加入終止液后需要立即讀板，盡量在10min內讀完
本底偏高	洗板操作不當導致洗板不徹底	確保各孔都被添加了足夠的洗液；2. 如果使用洗板機，檢查出液孔是否堵塞
	TMB顯色液污染	更換新的TMB顯色液
	TMB孵育時間過長	使用計時器，隨時注意實驗時間

 

HB221124