產品說明書
FAQ
COA
已發表文獻
產品信息
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產品名稱 |
產品編號 |
規格 |
價格（元） |
促銷價（元） |
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Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (抗體法，High Rox) |
11200ES03 |
1 ml |
336.00 |
196.00 |
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11200ES08 |
5×1 ml |
1466.00 |
586.00 |
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11200ES50 |
10×5 ml |
11086.00 |
11086.00 |
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11200ES60 |
20×5 ml |
17596.00 |
17596.00 |
產品描述
本產品是2×實時定量PCR擴增的預混合溶液。采用的抗體法熱啟動DNA聚合酶（貨號：10113ES），在預變性溫度（95℃）加熱30sec，UNICON® Taq抗體失活，釋放出Taq DNA Polymerase活性?？贵w法熱啟動Taq酶可以有效抑制引物非特異性退火導致的擴增。同時，配方優化了有效抑制非特異性PCR擴增的因子和提升PCR反應擴增效率的因子，適合低濃度模板的擴增，使定量PCR可以在寬廣的定量區域內獲得良好的標準曲線。
Mix中含有Hieff® Taq DNA Polymerase、UNICON® Taq抗體、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+及High Rox。使用時，僅需在擴增體系中加入模板和引物即可進行實時熒光定量PCR，大大簡化操作過程，降低污染幾率。
適用機型
Applied Biosystems: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT FAST, StepOne, StepOne Plus.
運輸與保存方式
冰袋運輸。-20℃避光儲存，有效期18個月。
本品避免反復凍融。產品中含有熒光染料SYBR Green I，保存或配制反應體系時需避免強光照射。
注意事項
1. 解凍后Master Mix可能出現絮狀物質，4℃放置并上下顛倒混勻至溶液澄清，不影響試劑性能。
2. 推薦使用本公司cDNA合成試劑盒（貨號：11123ES），以有效去除RNA樣品中殘留的基因組。
3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
4. 本產品僅作科研用途！
反應體系（推薦冰上配制）
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組分 |
體積（μl） |
體積（μl） |
終濃度 |
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Hieff UNICON® qPCR SYBR® Green Master Mix (抗體法，High Rox) |
25 |
10 |
1× |
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Forward Primer (10 μM) |
1 |
0.4 |
0.2 μM |
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Reverse Primer (10 μM) |
1 |
0.4 |
0.2 μM |
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模板DNA |
X |
X |
- |
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無菌超純水 |
to 50 |
to 20 |
- |
【注】： 使用前務必充分混勻，避免劇烈震蕩產生過多氣泡。
a) 引物濃度：通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據情況在0.1-1.0 μM之間進行調整。
b) 模板濃度：如模板類型為未稀釋cDNA原液，使用體積不應超過qPCR反應總體積的1/10。
c) 模板稀釋：cDNA原液建議5-10倍稀釋，最佳模板加入量以擴增得到的CT值在20-30個循環為好。
d) 反應體系：推薦使用20 μl或50 μl，以保證目的基因擴增的有效性和重復性。
e) 體系配制：請于超凈工作臺內配制，并使用無核酸酶殘留的槍頭、反應管；推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染和氣溶膠污染。
擴增程序（兩步法） 擴增程序（三步法）
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循環步驟 |
溫度 |
時間 |
循環數 |
循環步驟 |
溫度 |
時間 |
循環數 |
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預變性 |
95℃ |
30 sec |
1 |
預變性 |
95℃ |
30 sec |
1 |
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變性 |
95℃ |
10 sec |
40 |
變性 |
95℃ |
10 sec |
40 |
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退火/延伸 |
60℃ |
30 sec★ |
退火 |
55-60℃ |
20 sec |
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延伸 |
72℃ |
20 sec★ |
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熔解曲線階段 |
儀器默認設置 |
1 |
熔解曲線階段 |
儀器默認設置 |
1 |
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【注】高特異性可選擇兩步法，高效率擴增可選擇三步法。
a) 預變性時間：本反應條件適合大多數基因擴增，如果遇到含有復雜結構的基因可適當增加預變性時間至3-5min。
b) 退火溫度和時間：請根據引物和目的基因的長度進行調整。
c) 熒光信號采集（★）：請按照儀器使用說明書要求進行實驗程序設置，幾種常見儀器的時間設定如下：
30sec以上：Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96
31sec以上：Applied Biosystems: 7300
34sec以上：Applied Biosystems: 7500
d) 熔解曲線：通常情況下可以使用儀器默認程序。
結果分析
定量實驗至少需要三個生物學重復。反應結束后需要確認擴增曲線及熔解曲線。
1) 擴增曲線：標準擴增曲線為S型。
Ct值落在20-30之間時，定量分析最準確；
Ct值小于10，需要將稀釋模板后，重新進行實驗；
Ct值介于30-35之間時，需要提高模板濃度，或者增大反應體系的體積，以提高擴增效率，保證結果分析的準確性；
Ct值大于35時，檢測結果無法定量分析基因的表達量，但可用于定性分析。
2) 熔解曲線：
熔解曲線單峰，表明反應特異性好可以進行定量結果分析；若熔解曲線出現雙峰或者多峰，則不能進行定量分析。
熔解曲線出現雙峰，需要通過DNA瓊脂糖凝膠電泳判斷非目標峰是引物二聚體還是非特異性擴增。
如果是引物二聚體，建議降低引物濃度，或者重新設計擴增效率高的引物。
如果是非特異性擴增，請提高退火溫度，或者重新設計更高特異性的引物。
引物設計指南
1）推薦引物長度25 bp左右。擴增產物長度150 bp為佳，可以在100 bp-300 bp內選擇。
2）正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超過2℃。引物Tm值60℃-65℃為佳。
3）引物堿基分布要均勻，避免出現連續的4個相同堿基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一個堿基最好為G或C。
4）引物內部或者正反兩條引物間最好避免出現有3個堿基以上的互補序列。
5）引物特異性需要用NCBI BLAST程序進行核對。避免引物3’端有2個堿基以上的非特異性互補。
6）設計完成的引物需要進行擴增效率的檢測，只有具備相同擴增效率的引物才可用于定量比較分析。
相關產品
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產品名稱 |
貨號 |
規格 |
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Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) |
11121ES60 |
100 T |
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Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus) |
11123ES60 |
100 T |
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11201ES08 |
5 mL |
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11202ES08 |
5 mL |
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11203ES08 |
5 mL |
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Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗體法，No Rox) |
11195ES08 |
5 mL |
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Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗體法，Low Rox) |
11196ES08 |
5 mL |
|
Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗體法，High Rox) |
11197ES08 |
5 mL |
|
11198ES08 |
5 mL |
|
|
11199ES08 |
5 mL |
|
|
11200ES08 |
5 mL |
HB210824
400-6111-883
