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    Hieff? qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox)

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    產品說明書

    FAQ

    COA

    已發表文獻

    產品信息

     

    產品名稱

    產品編號

    規格

    價格(元)

    促銷價(元)

    Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)

    11201ES03

    1 mL

    185.00

    180.00

    Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)

    11201ES08

    5×1 mL

    740.00

    498.00

    Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)

    11201ES50

    50×1 mL

    6755.00

    4485.00

    Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)

    11201ES60

    100×1 mL

    12755.00

    8525.00

     

    產品描述

     

    Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox)2×實時定量PCR擴增的預混合溶液。Mix中含有熱啟動Hieff® DNA Polymerase、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+。使用時,僅需在擴增體系中加入模板和引物即可進行實時熒光定量PCR,大大簡化操作過程,降低污染幾率。

    本品采用的DNA聚合酶配體可以隨溫度變化實時調節DNA聚合酶活性。配方添加了有效抑制非特異性PCR擴增的因子和提升PCR反應擴增效率的因子,使定量PCR可以在寬廣的定量區域內獲得良好的線性關系。

     

    適用機型

     

    Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

    Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

    Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

    Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96;

    Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR.

     

    運輸保存方式

     

    冰袋運輸。-20避光儲存,有效期18個月。

    本品避免反復凍融。產品中含有熒光染料SYBR Green I,保存或配制反應體系時需避免強光照射。

     

    注意事項

     

    1. 推薦使用本公司cDNA合成試劑盒(貨號11123ES),以有效去除RNA樣品中殘留的基因組。

    2. 解凍后Master Mix可能出現絮狀物質,4℃放置并上下顛倒混勻至溶液澄清,不影響試劑性能。

    3. 為了您的安全和健康,請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

    4. 本產品僅作科研用途!

     

    反應體系(推薦冰上配制)

     

    組分

    體積(μL

    體積(μL

    終濃度

    Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)

    25

    10

    Forward Primer (10 μM)

    1

    0.4

    0.2 μM

    Reverse Primer (10 μM)

    1

    0.4

    0.2 μM

    模板DNA

    X

    X

    -

    無菌超純水

    to 50

    to 20

    -

    使用前務必充分混勻,避免劇烈震蕩產生過多氣泡。

    a) 引物濃度:通常引物終濃度為0.2 μM,也可以根據情況在0.1-1.0 μM之間進行調整。

    b) 模板濃度:如模板類型為未稀釋cDNA原液,使用體積不應超過qPCR反應總體積的1/10。

    c) 模板稀釋cDNA原液建議5-10倍稀釋,最佳模板加入量以擴增得到的CT值在20-30個循環為好。

    d) 反應體系:推薦使用20 μL50 μL,以保證目的基因擴增的有效性和重復性。

    e) 體系配制:請于超凈工作臺內配制,并使用無核酸酶殘留的槍頭、反應管;推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染和氣溶膠污染。
     

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    : 高特異性可選擇兩步法,高效率擴增可選擇三步法。

    a) 預變性時間:根據不同模板和引物的具體情況可適當縮短至2 min。

    b) 退火溫度和時間:請根據引物和目的基因的長度進行調整。

    c) 熒光信號采集(:請按照儀器使用說明書要求進行實驗程序設置,幾種常見儀器的時間設定如下:

    30sec以上:Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast;Roche Applied Science: LightCycler 480;Bio-Rad: CFX96

    31sec以上:Applied Biosystems: 7300

    34sec以上:Applied Biosystems: 7500

    d) 熔解曲線:通常情況下可以使用儀器默認程序。

     

     

    結果分析

     

     

    定量實驗至少需要三個生物學重復。反應結束后需要確認擴增曲線及熔解曲線。

    1) 擴增曲線:標準擴增曲線為S型。

    Ct值落在20-30之間時,定量分析最準確;

    Ct值小于10時,需要將稀釋模板后,重新進行實驗;

    Ct值介于30-35之間時,需要提高模板濃度,或者增大反應體系的體積,以提高擴增效率,保證結果分析的準確性;

    Ct值大于35時,檢測結果無法定量分析基因的表達量,但可用于定性分析。

    2) 熔解曲線:

    熔解曲線單峰,表明反應特異性好可以進行定量結果分析;若熔解曲線出現雙峰或者多峰,則不能進行定量分析。

    熔解曲線出現雙峰,需要通過DNA瓊脂糖凝膠電泳判斷非目標峰是引物二聚體還是非特異性擴增。

    如果是引物二聚體,建議降低引物濃度,或者重新設計擴增效率高的引物。

    如果是非特異性擴增,請提高退火溫度,或者重新設計更高特異性的引物。

     

    引物設計指南

     

    1. 推薦引物長度25 bp左右。擴增產物長度150 bp為佳,可以在100 bp-300 bp內選擇。

    2. 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超過2。引物Tm值60-65為佳。

    3. 引物堿基分布要均勻,避免出現連續的4個相同堿基,GC含量控制在50%左右。3’端最后一個堿基最好為G或C。

    4. 引物內部或者正反兩條引物間最好避免出現有3個堿基以上的互補序列。

    5. 引物特異性需要用NCBI BLAST程序進行核對。避免引物3’端有2個堿基以上的非特異性互補。

    6. 設計完成的引物需要進行擴增效率的檢測,只有具備相同擴增效率的引物才可用于定量比較分析。

     

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    HB210720

    400-6111-883

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