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    細胞激活劑──鈣離子載體離子霉素 Ionomycin

     

    離子霉素(Ionomycin),一種來源于Streptomyces conglobatus的聚醚類窄譜抗生素,是一種有效的鈣離子載體,高度選擇性結合鈣離子,也能轉運其他離子,但親和力相對較低(Ca2+ >Mg2+ >>Sr2+=Ba2+)。Ionomycin通過直接刺激鈣池調控鈣內流,提高胞內鈣離子水平。Ionomycin常用的有效濃度為:1-10 μM。

     

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    圖1 離子霉素游離酸分子結構式(CAS NO: 56092-82-0)

     

    image2.png

     

    圖2 離子霉素鈣鹽分子結構式(CAS NO: 56092-82-1)

    在細胞內,Protein kinase C (PKC)的激活,可以引起下游眾多蛋白激酶的磷酸化,形成級聯反應,導致多種蛋白的表達,進而引起細胞的活化。PKC可以在DAG(二脂酰甘油)和Ca2+共同作用下被激活。Ionomycin常與PKC激活劑PMA聯用,刺激免疫細胞活化,同時也加入蛋白轉運抑制劑(通常是Monensin或Brefeldin A)阻止高爾基體將新分泌蛋白運輸到細胞外,以增強細胞內細胞因子的檢測。如果是對分泌蛋白進行免疫檢測(例如 ELISA、蛋白免疫印跡或多重蛋白檢測),則無需使用Monensin或Brefeldin A對細胞進行處理。

    PMA和Ionomycin活化免疫細胞產生細胞因子步驟(用于流式檢測)

    1、試劑準備

    ① Ionomycin, 0.5 mg/mL用純乙醇配制。分裝為20 μL/管,–20°C可保存6個月。

    ② Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), 0.1 mg/mL用DMSO配制。分裝為20 μL/管,–20°C可保存6個月。

    2、無菌條件下從健康人的外周血中分離PBMC。

    ① 用無菌PBS按照1:1稀釋全血;

    ② 加入等體積的Ficoll-Paque,室溫下400× g離心20-30 min;

    ③ 收集交界處的PBMC,加入無菌PBS,4°C下300× g 離心5 min,丟棄上清液,重復兩次洗滌細胞;

    ④ 加入RPMI 1640完全培養基重懸細胞,繼續培養;

    3、PMA/Ionomycin刺激細胞

    收集細胞計數,用新鮮培養基重懸至細胞密度為1~2×106 cells/mL,加入PMA (10 ng/mL)和Ionomycin (1 μg/mL)混勻,37 ℃ 5% CO2培養4~6 h(不要超過6 h)

    注:根據實驗需求,選擇是否需要加入蛋白轉運抑制劑Monensin或Brefeldin A。

    4、4°C下300× g 離心5 min,去除上清,收集細胞進行流式細胞染色,檢測細胞因子表達情況(如IFN-γ、IL-2、TNF-α等)。

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    貨號

    產品名稱

    50401ES

    Ionomycin,Calcium Salt 離子霉素,鈣鹽

    50402ES

    Ionomycin,Free Base 離子霉素,游離酸

    50601ES

    PMA(TPA) 佛波肉荳蔻醋酸

    50501ES

    Monensin Solution(1,000×) 莫能霉素溶液(1,000×)

    50502ES

    Brefeldin A(BFA,5 mg/mL) 布雷非德菌素A

     

    已發表文章(部分)

    [1] Zhao M, Duan N, et al. CD5+ B lymphocytes secrete IL-10 rather than TGF-β1 which control the immune response in autoimmune haemolytic anaemia/Evans syndrome. Autoimmunity. 2019 Feb;52(1):12-20.  PMID: 30784322 IF: 2.5

    [2] Chen R, Ning Y et al. The miR-193a-5p/NCX2/AKT axis promotes invasion and metastasis of osteosarcoma[J]. J Cancer. 2021 Aug 8;12(19):5903-5913. PMID: 34476004 IF: 3.932

    [3] Xu S, Cheng X, et al. Capsaicin induces mitochondrial dysfunction and apoptosis in anaplastic thyroid carcinoma cells via TRPV1-mediated mitochondrial calcium overload. Cell Signal. 2020 Nov;75:109733. PMID: 32771398 IF: 4.132

    [4] Ma H, Tan Y, Wen D, et al. DC-CTL targeting carbonic anhydrase IX gene combined with iAPA therapy in the treatment of renal cell carcinoma. Hum Vaccin Immunother. 2021 Nov 2;17(11):4363-4373. PMID: 34851805 IF: 3.059 

     

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