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    氧化應激|自由基清除實驗全攻略

    氧化應激(oxidative stress)是指機體在遭受各種有害刺激時,體內高活性分子如活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)自由基產生過多,氧化程度超出氧化物清除能力,氧化系統和抗氧化系統動態失衡,從而導致細胞和組織損傷的一種狀態。研究表明機體內氧化還原水平失衡導致的氧化應激是眾多疾病的病理生理基礎,防御氧化應激,主要依靠機體內的抗氧化體系。根據清除機制的不同,抗氧化體系大致可分為兩個系統:酶抗氧化系統和非酶抗氧化系統。

    體系內各種抗氧化大分子、小分子和酶的總水平,反映了該體系內的總抗氧化能力(T-AOC)。T-AOC能更全面地評價體液、細胞和組織勻漿、食品和飲料的抗氧化劑含量,廣泛應用于醫學、食品科學等相關研究。

    1 自由基和抗氧化劑之間的不平衡導致氧化應激(圖源百度)

     

    抗氧化能力有哪些檢測方法?

     

    DPPH

    即二苯基苦基苯肼,DPPH是一種穩定的氮中心顯色自由基,在517nm波長處產生特征吸收峰。樣本中的抗氧化物質會使DPPH的吸光度減小直至消失,其吸光度的變化量在一定區間內與抗氧化物質含量呈線性關系。

     

    ABTS

    2,2’-聯氮-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸),又稱TEAC法,ABTS與適當氧化劑作用后,會生成藍綠色的ABTS陽離子自由基(ABTS+),在734nm波長處產生特征吸收峰,當抗氧化物質存在時,ABTS+的生成會受到抑制,使吸光度降低。與Trolox標準對照體系相比較,就能計算出樣本的總抗氧化能力(TEAC值)。

     

    FRAP

    FRAP法(ferric reducing antioxidant power),即在酸性條件下,Fe3+-TPTZ被樣本中的抗氧化物質還原為藍色的Fe2+-TPTZ,并在593nm波長處產生特征吸收峰。以Fe2+為標準,通過吸光度的大小,可以計算樣本的抗氧化能力。FRAP法測定步驟簡單,速度快,但其本質是以Fe2+進行等量替代的計算方法,反應本身并不具備抗氧化能力的生物學相關性。

     

    檢測方法的選擇

    抗氧化能力的評價方法,因檢測原理、反應條件等的不同而多種多樣,每一種方法都有其適用范圍和特點。

    目前,還沒有哪一種方法能夠全面地評價出樣本的總抗氧化能力。實驗中,往往需要至少兩種方法同時測定。對于具體樣本,應根據分析條件和作用底物等因素,綜合選擇相應的檢測方法。

    DPPH法、FRAP法和 ABTS法較為簡便易行,但DPPH、ABTS的化學性質使其偏離生物環境較遠;FRAP法和ABTS法在結果上具有很好的相關性與一致性,尤其是在成本和操作上,具有明顯的比較優勢。

     

    實驗步驟(僅供參考)

     

    DPPH

    1. DPPH反應液配制:準確稱取0.0039 g DPPH試劑(Yeasen Cat.NO 60310ES)溶于乙醇中,室溫避光下攪拌2 h,定容至100 mL[1];

    2. 檢測方法:將樣品與DPPH19的體積比混勻,室溫避光反應30 min后,在517 nm處測定吸光值;

    3. 結果表示:以TroloxYeasen Cat.NO 60309ES)當量測定抗氧化能力。

     

    ABTS

    1. ABTS反應液配制:ABTSYeasen Cat.NO 60328ES溶于pH值為4.5的醋酸鈉溶液中配制7.4 mmol/LABTS溶液,ABTS2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液以11體積比混勻,室溫下避光靜置12 h[2] ;

    2. 檢測方法:將樣品與反應液以19的體積比混勻,避光反應30 min后,734nm檢測吸光度;

    3. 結果表示:以TroloxYeasen Cat.NO 60309ES)當量測定抗氧化能力。

     

    FRAP

    1. FRAP反應液配制:TPTZYeasen Cat.NO 60329ES溶于40 mmol/L HCl 配制7 mmol/LA工作液,并分別制備20 mmol/LFeCl3B工作液)和300 mmol/LpH3.6醋酸鈉溶液(C工作液),將A: B: C體積比為10:1:1混勻得FRAP工作液。

    2. 檢測方法:配制濃度為0.031~4mMFeSO4標準溶液。將各濃度標準溶液與工作液分別以129的體積比混勻,避光反應15 min后,在593 nm處測定吸光值,繪制吸光值與FeSO4濃度標準曲線。  

    3. 結果表示:將樣品與FRAP反應液混勻后測定其吸光值,樣品的FRAP自由基清除能力用FeSO4當量濃度表示[3]。

     

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    產品名稱

    貨號

    規格

    目錄價(元)

    純度

    Trolox

    60309ES25/60/76

    250 mg/1/5 g

    155/355/1155

    ≥98%

    1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)

    60310ES25/60

    250 mg/1 g

    285/695

    ≥97%

    ABTS,Diammonium Salt ABTS二銨鹽

    60328ES03

    1 g

    398

    ≥98%

    2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ

    60329ES03

    1 g

    275

    ≥99%

     

    其他相關試劑

     

    產品名稱

    貨號

    規格

    目錄價(元)

    NAD氧化型輔酶I

    60323ES08/25/60/76

    5/25/100/500 g

    288/1188/3948/16588

    NADP•Na2氧化型輔酶II二鈉

    60324ES03/08/25/60

    1/5/25/100 g

    210/878/3658/12188

    Glutathione, Oxydized (GSSG) 氧化型谷胱甘肽(GSSG)

    60341ES03/08

    1/5 g

    279/1148

    Glutathione, Reduced(GSH) 還原型谷胱甘肽(GSH)

    60342ES10/60/80

    10/100 g/1 kg

    209/1156/4596

    Reactive Oxygen Species Assay Kit 活性氧(ROS)檢測試劑盒

    50101ES01

    1 Kit (1000 tests)

    965

    Catalase Assay Kit 過氧化氫酶檢測試劑盒

    50108ES60

    100 T

    349.00

     

    參考文獻

     

    [1] Hui T,et al.Food and Chemical Toxicology.129(2019)138-143. 

    [2] Leyla Pa,sayeva,et al.Antioxidants 2022, 11, 2284.

    [3] Thaina Omia Bueno-Pereira,et al.Antioxidants 2022,11,2111.

     

     

    400-6111-883

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